沃吉：如何利用PCR Array做临床大队列找biomarker研究

诺扬生物
2025-05-07


文章标题Article Title：

Combined analysis of a serum mRNA/miRNA marker signature and CA 19‐9 for timely and accurate diagnosis of recurrence after resection of pancreatic ductal adenocarcinoma: A prospective multicenter cohort study


研究背景

胰腺癌被称为 “癌中之王”，5年生存率仅约10%，预计2040年将成为全球第二大癌症死因。即使接受手术切除，超80%患者会复发，而传统影像学检查（如CT/MRI）和肿瘤标志物CA 19-9常因灵敏度不足，导致复发发现延迟，错失最佳治疗窗口。

突破性进展

7个基因+CA 19-9 联合检测，准确率高达90%！mRNA/miRNA有望成为非侵入性生物标志物

材料与方法      

收集146例患者术后血清样本，分为NED组(74例)和复发组(77例)。5例患者的连续样本用于时间序列分析。

a：TNM classification according to UICC eighth edition.b：All patients received adjuvant treatment according to local standards.


样本来源、分组标准、样本采集


Fig.1表明，尽管在临床诊断时，表现最佳的标记组合能够可靠地诊断复发，但在无临床复发证据的时间点，其表现不太一致。这可能意味着在存在微小残留疾病或早期复发阶段，分类结果接近阈值，不同的mRNA/miRNA组合表现存在差异。同时，部分患者在临床诊断复发前，分子诊断已能检测到复发迹象，说明新开发的分子诊断方法结合临床随访程序，有可能更早地检测到胰腺癌患者术后肿瘤复发。



RNA提取、PCR Array检测与分析


1. 技术核心：同步检测mRNA/miRNA的 “多维度分子扫描”

•创新性：传统检测通常单独分析mRNA或miRNA，而该研究通过定制化引物混合液+微流控芯片，实现两种核酸分子的同步提取、反转录、预扩增及检测，大幅提升效率并减少样本损耗（仅需20–200ng RNA）。

•技术优势：

☆高通量：单张芯片覆盖96个反应腔，可同时检测42个mRNA、25个miRNA 及内参基因，支持多标志物联合分析（如后续筛选出的7基因组合）。

☆标准化：统一的反转录、预扩增及PCR条件，降低实验误差，确保不同中心样本数据的可比性。

2. 关键步骤：预扩增——微量样本的 “信号放大”
•反转录后进行预扩增，针对目标基因设计特异性引物，选择性放大靶标核酸信号，避免非特异性扩增。
•该步骤尤其适合血清中微量游离 RNA（cfRNA/cfmiRNA）的检测，解决了液体活检中 “样本核酸浓度低、背景干扰强” 的难题，为后续精准定量奠定基础。
3. 临床转化潜力：从 “实验室” 到 “病床” 的桥梁
•非侵入性：仅需血清样本（500μL），避免组织活检的创伤，适合术后长期随访（如研究中对5例患者连续采集4次样本）。
•多癌种适配：研究前期已验证该芯片对胰胆管肿瘤的鉴别能力，本次拓展至胰腺癌术后复发监测，显示技术平台的通用性，未来可延伸至其他癌症类型。



研究结果

血清特异性联合微RNA和mRNA生物标志物PCR Array的设计       该PCR Array通过调整mRNA/miRNA标记物组合、设置内部对照，并结合经典标志物CA 19-9的独立检测，实现了从侵入性组织活检到非侵入性血清检测的技术转化。其设计逻辑兼顾了分子功能互补性、实验可靠性及临床可操作性，为液体活检在肿瘤诊断中的应用提供了关键技术支撑。

完整标记物列表见下表3



样本分组&数据分析


       本研究通过严谨的样本分组、严格的数据质量控制及全组合标记物筛选，结合LOOCV验证的5NN分类器，开发了基于血清的7标记物组合模型（含CA 19-9、CLDN3等），诊断准确率达90%。其核心创新在于将侵入性组织活检的分子诊断技术转化为非侵入性液体活检，并通过多组学联合分析显著提升了复发诊断的准确性，为癌症患者的动态监测与精准治疗提供了新工具。



最终保留10个mRNA和10个miRNA标记物（上图表 2），这些标记物与CA 19-9值联合用于分析。



Fig.2：数据分析过程的示意图。



Fig.3：7标记物组合的诊断性能最佳（准确率 90%；灵敏度 98%；特异度 84%）


Fig.4a：展示前 100 个表现最佳的生物标志物组的诊断准确性，且不考虑每组中包含的特征数量，以评估不同组合的总体性能。
Fig.4b：展示 21 个个体标记物在前 100 个生物标志物组中的出现情况，以确定每个标记物对整体性能的贡献。


时间序列数据分析

       时间序列数据分析表明，尽管最佳表现的标记物组合在临床诊断复发时具有可靠性，但在早期或无临床证据的阶段，其预测能力可能受到一定限制。这提示在实际应用中，需要结合临床情况和其他因素来综合判断肿瘤的复发情况。




讨论部分


1

研究核心创新与临床价值

1）首个血清多分析物面板用于 PDAC 术后复发早检；

2）多组学联合的优势；

3）成本效益与可及性。


2

与现有研究的对比与定位。

1）与ctDNA及外泌体miRNA研究的差异；

2）对CA 19-9的优化而非替代。


3

局限性与未来方向

1）主要局限：样本异质性、缺乏独立验证集、RNA保存与处理问题。

2）未来研究重点：前瞻性大规模验证、与其他技术联合、个体化治疗衔接。


4

科学意义与临床转化前景

1）概念突破；

2）技术示范；

3）医疗经济价值。

文章来源Article From:

Buchholz M, Lausser L, Schenk M, Earl J, Lawlor RT, Scarpa A,Sanjuanbenito A,Carrato A,Malats N,Tjaden C,Giese NA,Büchler M,Hackert T,Kestler HA,Gress TM;BioPaC consortium.Combined analysis of a serum mRNA/miRNA marker signature and CA 19-9 for timely and accurate diagnosis of recurrence after resection of pancreatic ductal adenocarcinoma: A prospective multicenter cohort study.United European Gastroenterol J.2025 Apr;13(3):353-363. doi: 10.1002/ueg2.12676.Epub 2024 Oct 25.PMID:39453683;PMCID:PMC11999032.

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