ORIGINAL ARTICLE | Open Access

Rongrong Zhao, Ziwen Pan, Jiawei Qiu, Boyan Li, Yanhua Qi, Zijie Gao, Wei Qiu, Weijie Tang, Xiaofan Guo, Lin Deng, Gang Li, Hao Xue

Cancer Communications. 2025

https://doi.org/10.1002/cac2.70016

1. MES-GBM与hypoxic MDM亚群构成新辅助免疫治疗抵抗的“双重防线”

通过对11例接受新辅助抗PD-1治疗的GBM患者样本进行单细胞与空间多组学分析，鉴定了间充质亚型肿瘤细胞（MES-GBM）和一群具有低氧特征的髓源性巨噬细胞（hypoxic MDM）在新辅助抗PD-1治疗无应答患者中的特异性富集。空间转录组分析显示，MES-GBM与hypoxic MDM在低氧区域形成紧密的空间互作生态位，协同激活低氧响应信号及多维度促癌信号，共同构建支持免疫逃逸的局部生态位。生存分析表明，两群体的共富集与患者生存期缩短显著相关，提示其协同构成抗PD-1治疗的“双重防线”。

2. circSDHAF2促进MES-GBM细胞亚群的形成

由于MES-GBM和hypoxic MDM是与新辅助抗PD-1治疗效果差相关的主要细胞亚型，我们接下来通过选择与MES-GBMs、hypoxic MDM以及免疫浸润评分为特征，筛选出了与这些特征高富集评分相关的circRNA，发现circSDHAF2与这些特征密切相关。进一步体内外功能实验证明，circSDHAF2可促进MES-GBM亚群的形成。

3. circSDHAF2稳定ITGA5蛋白促进MES-GBM亚群的形成

然后我们进行了Co-IP以及质谱测序，寻找与circSDHAF2结合的潜在蛋白，共检测到282个蛋白。进一步基于TCGA-GBM队列数据，我们将患者生存周期、MES-GBM评分、hypoxic MDM浸润评分及免疫富集评分作为性状参数，运用WGCNA包对282个签字啊的结合蛋白构建无尺度共表达网络，并解析出四组特征模块。其中，棕褐色模块（brown module）与上述临床病理特征显著关联。进一步通过模块特征基因筛选，发现整合素α5（ITGA5）与该模块呈现最强相关性，提示其可能为circSDHAF2的潜在互作靶标。进一步通过RNA Pull-down、RIP-qPCR及CHX追踪等一系列实验证实circSDHAF2通过抑制ITGA5蛋白泛素-蛋白酶体降解促进ITGA5蛋白稳定性。最后挽救实验证实circSDHAF2通过稳定ITGA5蛋白促进MES-GBM亚群的形成。

4. circSDHAF2通过B4GALT1介导的N -糖基化修饰稳定ITGA5蛋白表达

与WGCNA棕色模块相关度第二强的蛋白是N -糖基转移酶B4GALT1，其可以催化蛋白质发生N -连接糖基化修饰。我们发现ITGA5具有丰富的N-糖基化位点，进一步半衰期实验分析显示N -糖基化修饰增强了ITGA5蛋白的稳定性。为了确定circSDHAF2是否通过促进ITGA5的泛素化修饰来拮抗ITGA5的N-糖基化修饰，从而增强其蛋白稳定性，我们用N-糖基化修饰抑制剂处理细胞，发现ITGA5的泛素化修饰水平升高，且circSDHAF2诱导的ITGA5蛋白泛素化水平的降低可以被N-糖基化修饰抑制剂所挽救。综上所述，我们的研究结果表明circSDHAF2增强了ITGA5的N -糖基化修饰，从而抑制了ITGA5的泛素化和降解。

5. circSDHAF2通过B4GALT1介导的N -糖基化修饰促进ITGA5到外泌体的分选

单细胞数据和空间转录组数据进一步揭示MES-GBM细胞和hypoxic MDM广泛分布在缺氧区域。然后我们对缺氧刺激的GSCs及其外泌体进行了蛋白质组学测序，发现整合素膜蛋白ITGA5在这两种细胞和外泌体中显著上调。据此，我们推测B4GALT1调控的ITGA5 N-糖基化介导了其向外泌体的转运。进一步实验发现缺氧增加了B4GALT1与ITGA5的结合强度，并且过表达circSDHAF2上调了外泌体中的ITGA5表达，但这一效应可以通过敲低B4GALT1来逆转。这些结果表明，circSDHAF2通过促进B4GALT1介导的ITGA5 N-糖基化来促进其向外泌体的转运。

6. MES-GBM的外泌体ITGA5蛋白通过FAK/RUNX1轴促进SPP1⁺ MDM亚群形成

进一步通过生信分析与功能实验证明，MES-GBM细胞通过circSDHAF2/ITGA5轴上调CCL2促进MDM的浸润，进一步将携带ITGA5蛋白的外泌体递送至MDM激活FAK/RUNX1信号轴促进SPP1的转录上调进而诱导SPP1⁺ MDM（也称为hypoxic MDM）亚群形成；接下来的共培养实验表明，SPP1⁺ MDM亚群可通过SPP分泌蛋白反向作用于MES-GBM细胞表面的ITGA5受体进一步诱导MES-GBM细胞的形成。这些结果表明circSDHAF2介导的ITGA5-SPP1通路参与了一种自我放大机制，涉及MES-GBM细胞与SPP1+ MDMs之间的相互作用，促进局部免疫抑制性TME生态位的形成。

７. 靶向阻断ITGA5增强GBM对抗PD -1的治疗敏感性

进一步通过cellchart通讯网络和体外实验发现SPP1⁺ MDM可通过SPP1-整合素α5β1（ITGB1+ITGA5）信号介导T细胞亚群的功能失调。为明确SPP1-ITGA5信号通路的临床意义，我们在TCGA GBM队列中开展生存分析。结果显示,同时高表达SPP1与ITGA5的患者总生存期最短。进一步GBM样本的空间转录组学分析进一步发现， ITGA5与SPP1高共表达区域与治疗响应率降低显著相关，提示二者协同驱动治疗耐药。据此，我们推测利用ITGA5阻断抗体阻断SPP1⁺ MDM的形成以及其介导的免疫抑制性TME形成可能是提高抗PD-1治疗GBM疗效的有效途径。我们进一步在CT2A原位GBM小鼠模型中验证了ITGA5阻断抗体对抗PD -1的治疗效果。我们发现，单用ITGA5阻断抗体或抗PD-1治疗均表现出部分抗肿瘤效应，而联合治疗组（anti-ITGA5 + anti-PD-1）则显示出显著的协同作用。这些结果表明靶向阻断ITGA5能增强anti-PD-1对GBM的治疗敏感性。

适用细胞：

各种正常组织细胞系、免疫细胞、白血病细胞、神经细胞、间充质干细胞等。

部分成功案例 ：

Vero(非洲绿猴肾细胞)、Hep3B(人肝癌细胞系)、ADSC(脂肪间充质干细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、HUH7(人肝癌细胞系)、杂交瘤细胞、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞株)、N2A(小鼠神经瘤母细胞)、星形胶质A549(人非小细胞肺癌细胞系)、CTC(循环肿瘤细胞)、

HepG2(人肝癌细胞株)、EC-1(食管癌细胞)、Hep3B(人肝癌细胞)、MRC-5(人胚肺成纤维细胞)、MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)、Hela(人子宫颈癌细胞)、RLE-6TN(大鼠肺上皮细胞)等等。